Científicos rosarinos desarrollaron una técnica genérica de amplificación de fragmentos largos de ADN que permitió caracterizar a un nuevo tipo de virus papiloma denominado HPV-156.

Foto: Adriana Giri (izquierda), Diego Chouhy y Elisa Bolatti, autores del estudio.
Una de las enfermedades más corrientes de transmisión sexual es la del virus del papiloma humano. El nombre de la innovación es PCR de la gota colgante para fragmentos largos. Se trata de una técnica de amplificación de fragmentos largos de ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de tipo anidada (nested-PCR), pero en donde no es necesaria la apertura del tubo de reacción entre los dos pasos de amplificación característicos de la nested-PCR.

La técnica de PCR de la gota colgante fue descripta en el año 2000 en un estudio liderado por Edward Walsh para amplificar regiones de ADN de entre 200-800 nucleótidos. Lo que este desarrollo logró, fue adaptar esta técnica para poder amplificar regiones de ADN de entre 3500-4500 nucleótidos, utilizando “cebadores genéricos” que facilitan la búsqueda de nuevos tipos de HPV.

“Nuestra innovación mostró tener una sensibilidad analítica entre 10-100 veces superior a las técnicas de PCR simple, lo que se traduce en una mayor probabilidad de identificación de nuevas cepas virales. Además, esta metodología sienta las bases para facilitar no sólo la identificación de nuevos HPV sino que también puede aplicarse en otras áreas de la biología y la microbiología”, detalla en diálogo con EL OTRO MATE Diego Chouhy, quien hizo este trabajo durante su tesis doctoral.

El desarrollo de la nueva técnica y la identificación del HPV-156 fue realizado bajo la dirección dela Dra. AdrianaGiri en el Laboratorio de Virología Humana del Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), que depende del CONICET.
El equipo de investigación se nutrió con la participación de la bióloga Elisa Bolatti del IBR-CONICET, y los Dres. Ramón Fernández Bussy, Adriana Sánchez, Gustavo Piccirilli y demás integrantes dela Cátedrade Dermatología dela Facultadde Ciencias Médicas de la UNR.

La tesis doctoral de Chouhy comenzó con el diseño y optimización de una metodología para identificar pequeños fragmentos de ADN (200-350 nucleótidos) de HPV cutáneos y mucosos que aplicaba la técnica de PCR de la gota colgante. A esta metodología la llamaron “Sistema CUT”, y les permitió hacer el primer relevamiento de HPV cutáneos en el país e identificar pequeños fragmentos de tipos de HPV desconocidos hasta entonces.

“El gran desafío era amplificr e identificar el genoma completo ( 7000-8000 nucleótidos) de estos virus desconocidos. Si bien en un inicio pudimos identificar y caracterizar el genoma completo de un nuevo virus (HPV-115, primer tipo de HPV caracterizado por un laboratorio de Sudamérica) utilizando una técnica de PCR simple, no tuvimos éxito en caracterizar otros tipos virales.

Debido a que ya habíamos observado que el sistema CUT (que utiliza la técnica de PCR de la gota colgante) tenía una sensibilidad superior comparada al mismo sistema pero utilizando una técnica de PCR simple, nos preguntamos si podíamos mejorar la sensibilidad de amplificación de fragmentos largos utilizando PCR de la gota colgante como estrategia de amplificación”, explica Chouhy.

Hasta el momento se han descrito los genomas completos de más de 150 tipos de HPV, el 75 por ciento de los cuales ha sido identificado en piel y el resto en mucosas. Los HPV que infectan mucosas son agentes causantes de distintas patologías anogenitales. En particular, el grupo de HPV denominados de “alto riesgo oncogénico”, como HPV-16 y HPV-18, está asociado al desarrollo de cáncer anogenital y de cabeza y cuello, tanto en mujeres como en hombres. Por otro lado, los tipos mucosos denominados de “bajo riesgo oncogénico”, como HPV-6 y HPV-11, se asocian al desarrollo de verrugas genitales benignas.

En contraste, el rol carcinogénico de los HPV cutáneos no es claro al momento. Hay evidencias que indican que podrían tener un rol en el desarrollo de cáncer de piel no melanoma, tales como el carcinoma cutáneo de células escamosas (que provoca uno de cada cinco de estos tumores y es más frecuente en población caucásica).

Pero en definitiva no se sabe si están o no asociados al cáncer de piel no melanoma. Uno de los problemas para establecer dicha asociación es que todavía no se conocen a todos los HPV cutáneos circulantes, probablemente debido a las dificultades técnicas para su identificación. Parte de estas dificultades provienen del hecho que los HPV cutáneos son muy divergentes entre sí y están presentes en la piel en muy bajo número de copias. Esto indudablemente dificulta su amplificación y caracterización. Es en base a esto que el nuevo método de amplificación facilitaría la identificación de nuevos tipos de HPV ya que presenta mayor sensibilidad analítica y es un método genérico, es decir permite la identificación de diversos tipos de HPV.

“La técnica desarrollada por nuestro grupo, es de utilidad para la búsqueda y caracterización de nuevos tipos de HPV, pero no está pensada para que se implemente como herramienta diagnóstica. De hecho no está recomendado realizar la búsqueda de HPV cutáneos como marcador de cáncer de piel no melanoma, ya que no sabemos si juegan o no un rol en este tipo de carcinogénesis.

“Las técnicas de amplificación han evolucionado constantemente desde el desarrollo de la técnica de PCR y las técnicas de secuenciación. En el futuro las técnicas de “secuenciación de alto rendimiento” podrían tener un rol clave, junto con las de amplificación de ADN, en la identificación de “todos” los tipos de HPV circulantes en epitelios cutáneos. Esta información es necesaria para poder de dilucidar si los HPV cutáneos están o no involucrados en el desarrollo del cáncer de piel no melanoma”, pronostica Chouhy.

Fuente: EL OTRO MATE

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